Fondato da Clemente XIV nel 1771 dopo l'acquisizione delle collezioni Mattei e Fusconi, esso venne ampliato dal suo successore, Pio VI, che gli diede un ingresso monumentale con l’Atrio dei Quattro Cancelli e la Scala Simonetti, da cui si accedeva all'atrio di ingresso, la Sala a croce greca.
Il museo oggi è collocato in 12 sale, comprensive del Cortile Ottagono, e ospita importanti collezioni di epoca greca e romana. Il percorso standardizzato per la visita si svolge in senso opposto alla numerazione originaria delle sale, cominciando dalla Galleria dei Candelabri e dalla Sala della Biga, e proseguendo nei seguenti ambienti:
I - Sala a Croce Greca
II - Sala Rotonda
III - Sala delle Muse
V - Galleria delle Statue
VI - Sala dei Busti
VII - Gabinetto delle Maschere
VIII - Cortile Ottagono
X - Gabinetto dell'Apoxyómenos
XI - Vestibolo
XII - Vestibolo Quadrato